Preimplantasyon Genetik Tanı

Ailesel kanser sendromu öyküsü bulunan ve kanser predispozisyonuna neden olan mutasyonların bulunduğu kişilerde preimplantasyon genetik tanı (PGT) işlemi, ancak set-up aşaması tamamlandıktan sonra yapılabilir. Set-up aşaması sonrasında anne adayı ortalama 10-12 gün süren bir hormon tedavisine alınarak çok sayıda yumurta elde edilmeye çalışılır. Elde edilen yumurta hücreleri içerisinden olgun (matür) olanlar seçilerek her birisi ayrı bir sperm hücresi ile mikroenjeksiyon işlemine alınır. İşlem sonrasında döllenen yumurtalar (embriyo) laboratuvar ortamında yaklaşık 5-6 gün bekletilir ve sonrasında anne adayına transfer edilir. PGT işlemi ise embriyolar transfer edilmeden önce 3. günde iyi gelişen embriyolardan (7-8 hücreli) alınan 1-2 hücre (blastomer) üzerinde  uygulanır.

Her bir blastomer hücresinde uygulanan PGT işlemindeki en önemli noktalardan birisi blastomerlerin başka bir hücreyle kontaminasyonunun engellenmesidir. Bu nedenle, blastomer örneğinin alındığı merkezin bu konuda deneyimli ve dikkatli olması gereklidir. Embriyolardan alınan her bir hücre, önceden hazırlanmış ve içerisinde gerekli solüsyonların bulunduğu ayrı bir steril pcr tüpüne aktarılarak kapakları sıkıca kapatılır ve PGT işleminin yapılacağı merkeze ulaştılırır. Bu işlemin uygulanmasının mümkün olmadığı durumlarda, four well adı verilen kap içerisine her bir blastomer için ayrı droplet yapılarak alınan hücreler konur ve transportu yapılır. Her iki yöntemde de blastomer numaralandırmasına çok dikkat edilmelidir.

PGT işleminin uygulanacağı merkeze ulaşan blastomerler, ilk olarak DNA eldesi için lizis solüsyonu ile yaklaşık 45 dakikalık bir işleme tabi tutulur. Elde edilen blastomerlere ait DNA örnekleri üzerine set-up aşamasında dizayn edilen mutasyona spesifik diziler eklenerek polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) için hazırlanır. Hazırlanan miksler, PCR cihazında daha önceden belirlenmiş ısılarda işleme tabi tutularak incelenecek gen ve marker lara ait diziler çoğaltılır. Elde edilen PCR ürünü, DNA dizi analizi yöntemi kullanılarak sekans cihazında tek tek diziyi oluşturan bazlar belirlenir. Belirlenen dizi üzerindeki mutasyon bölgesi incelenerek tanı konur.

PGT işleminin tek bir hücreden yola çıkılarak yapılması nedeniyle tüm çalışma sadece yumurta ve spermden gelen bir çift DNA sarmalından elde edilen ve bir çalışmada kullanılabilecek en az miktardaki DNA örneği üzerinde yapılır. Bu nedenle, bazı hücrelerde anne ve babadan gelen sarmallar PCR çalışmasında çoğaltılamaz ve buna bağlı olarak sonuç alınamayabilir (amplifikasyon başarısızlığı). Bazen de, anne veya babaya ait sarmallardan sadece bir tanesi amplifiye olmaz ve bu durum allel drop-out (ADO) olarak adlandırılır. ADO, yanlış tanıya neden olması nedeniyle PGT işlemi sırasında en çok korkulan durumdur. Bu durumun tanımlanabilmesi için mutlaka ikinci bir kontrol mekanizmasının analizde kullanılması gereklidir. Aileye özgü informatif marker ların kullanılması bu aşamada devreye girer ve ADO varlığının tespitini sağlar. ADO saptanan hücreler, sağlıklı bir değerlenme yapılamayacağı için için değerlendirme dışı bırakılırlar.

Değerlendirme sonrasında kanser predispozisyonuna neden olan mutasyonu taşımayan embriyolar anne adayına transfer edilir.